摘要现代药理研究表明，桑叶多糖对四氧嘧啶型糖尿病大鼠有明显的治疗作用，因此从天然桑叶提取物中分离、纯化得到桑叶多糖并研究其结构性质，对研制出治疗糖尿病的新药具有重要的学术意义和实用价值。本文利用水提醇沉法从桑叶中提取具有降血糖有效部位群的物质，主要为可溶的中性多糖，并进行纯化精制，以提高多糖含量。利用硫酸．葸酮法对其主要成分进行分析。首先，本文采用热水浸提法提取桑叶多糖，考察温度、提取次数对多糖提取率的影响，优化了桑叶多糖的水提取工艺，使总多糖的回收率达94．56％；在醇沉工艺中，考察了溶液pH值、乙醇浓度对醇沉效果的影响，确定最佳醇沉工艺条件，得到的醇沉物多糖含量为11．48％，提取率为11．10mg／g生药。其次，本文考察了II型ZTCI+I天然絮凝剂纯化桑叶多糖，采用正交实验得出了桑叶多糖的最佳絮凝工艺。在此工艺下，多糖保留率为96％以上，蛋白去除率为16％，浸膏中多糖含量平均为22％。该工艺的上述三项指标分别是醇沉工艺的2．26，2和1．8倍，明显优于醇沉工艺。另外，本文还对桑叶多糖的各种纯化方法进行了比较研究。考察了Savage法除蛋白对多糖及蛋白含量的影响，桑叶粗多糖中的蛋白含量约为2％左右，可以不去除或采用Sevage法一次去除蛋白；进行了桑叶多糖灰份的测定，并考察了超滤法去除无机物小分子；研究了活性炭及大孔吸附树脂的脱色效果，利用活性炭脱色，脱色率为91．72％；利用大孔吸附树脂脱色，脱色率为78．56％，并且多糖保留率高于活性碳工艺。本文还初步探讨了葡聚糖凝胶过滤的方法纯化桑叶多糖，相继用G．50和G．凝胶过滤，得到浅白色的多糖样品，多糖含量为24．85％。本文研究为天然桑叶多糖的提取与纯化工艺路线的选择提供了必要的基础数据与参考。关键词：桑叶；多糖；提取；分离；纯化随着世界范围内“回归自然”热潮的兴起，天然药物及中药的需求会逐渐扩大；随着我国中医药事业的不断发展，中医中药正逐渐被世界所认可。近年来，天然营养保健品和天然药物的研究开发已为国内外有关专家所重视。根据中医理论和现代科学技术分析，许多生物活性物质对人类的健康具有重要意义，它能起到保健或对某些疾病的防治作用。天然多糖是一类重要的生物活性物质，在自然界中分布广泛，资源丰富，在高等植物、藻类、细菌类以及动物体内均有多糖存在。在动物体内主要存在于细胞膜中，而在植物和微生物体内主要存在于细胞壁中。天然多糖具有多方面的生物活性和保健功能，可作为各种药物和保健品的有效成分，对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力。到目前为止，人们已经从自然界中提取出来的就有几百种，如仙人掌多糖、金耳多糖、海带多糖、螺旋藻多糖、灵芝多糖、鲍鱼多糖、鲨鱼软骨多糖等。国内外的大量研究证明，天然多糖具有以下多方面的生物活性的功能：(1)增强免疫的功能；(2)抗肿瘤的作用；(3)降血糖、降血脂；(4)抗病毒、抗细菌；(5)抗辐射等。桑叶为桑科植物桑(Morusalba．L)的叶，是国家卫生部公布的既是食品又是药品的药食两用植物，具有极高的营养价值和药用价值，含有多种活性成分，主要有多糖、生物碱、多肽、黄酮、多酚等。桑叶多糖作为一种天然多糖，经过现代药理研究表明其具有降血糖作用，对大鼠四氧嘧啶糖尿病具有治疗作用，因此提取、分离、纯化桑叶多糖成分制成各种中成药的前景十分广阔。桑叶多糖的提取主要有热水浸提法和超声提取法。热水浸提法应用广泛，操作简便，成本较低，容易工业化，且提取工艺简便，便于投产，但产量较少，耗时长；超声提取法产量略高于热水浸提法，且所耗时间，提取次数较少，但成本较高不利于工业化放大，且对设备要求较高，目前只限于实验室规模。目前，从文献检索来看，桑叶多糖的纯化比较困难，主要原因是对桑叶多糖的结构不熟悉，基础研究不够深入。近年来，国内又有一些学者采用天然澄清剂纯化多糖，主要包括II型ZTCI+I和壳聚糖这两种天然澄清剂。认为澄清剂在去除一些杂质如蛋白质、蜡质、鞣质、树脂等，保留药液中的有效成分，如多糖及可溶性固体物方面优于传统的水提醇沉法，具有有效、简便、成本低、增强稳定性的优点。本课题是石家庄第四制药厂全权委托的项目，主要为提取桑叶中具有降血糖作用的有效部位群，包括桑叶多糖和生物碱类两大类。课题组有其他人专门针对生物碱类进行提取，并进一步纯化。天津大学化工学院制药工程专业的高瑞昶高老师课题组对桑叶多糖的提取、纯化做了一部分研究，并取得了一些成果，本人是在他们以及文献的基础上进行桑叶的提取、纯化研究，主要采用热水浸提法提取多糖，所提取的多糖粗品杂质比较复杂，主要是一些色素、鞣质、蛋白质、无机小分子之类。针对这些杂质，本文进一步研究了桑叶多糖的分级醇沉效果和乙醇沉淀次数对多糖含量的影响；考察了Savage法除蛋白对多糖及蛋白质含量的影响；进行了桑叶多糖灰份的测定，考察利用超滤法去除小分子；研究了活性炭和大孔树脂的脱色效果；考察了Ⅱ型ZTCI+I澄清剂纯化桑叶多糖；最后，本文初步探讨了葡聚糖凝胶过滤纯化桑叶多糖。第一章第一章文献综述随着科学技术和人们生活水平的提高，人们对医疗保健品的追求越来越趋向回归大自然，天然营养保健品和天然药物的研究开发已为国内外有关专家所重视。根据中医理论和现代科学技术分析，动植物中含有许多生物活性物质，包含：多糖类、生物碱类、黄酮、多酚、皂甙等等，它们对人类的健康具有重要意义，能提高机体的免疫活性，使失去平衡的机体恢复正常，从而起到保健或对某些疾病的防治作用。天然多糖是一类重要的生物活性物质，具有多方面的生物活性和保健功能，可作为各种药物和保健品的有效成分，对于预防和治疗包括癌症在内的多种疾病都具有巨大的潜力。糖尿病是一种非常古老的疾病，中医称之为“消渴”，即消瘦烦渴之意，现代医学发现它是一种常见的内分泌疾病，极具杀伤力，是仅次于心血管疾病和肿瘤的“第三杀手”。桑叶多糖作为一种天然多糖，经过现代药理研究表明其具有降血糖作用，对大鼠四氧嘧啶糖尿病具有治疗作用，因此提取、分离、纯化桑叶多糖成分制成各种中成药的前景十分广阔。1．1多糖的研究进展多糖作为来自高等植物、动物细胞和微生物细胞壁中的天然高分子化合物，是构成生命的四大基本物质之一。多年前，德国著名科学家E．Fischer开始了糖类物质的研究。认为糖类及其复合分子具有十分重要的生物功能。20世纪50年代末对真菌多糖的抗癌效果的发现使人们开始了多糖系列的化学研究。20世纪60年代以后，人们逐渐发现作为糖类物质重要组成的多糖类物质有着特殊的生物活性功能，已发现不少多糖物质及其衍生物具有药用价值，尤其在抗凝血、抗血栓、抗血脂、调节免疫功能和抗肿瘤、抗放射方面都有显著的药理作用与疗效。近lO年来，随着分析技术的进步和分子生物学及细胞生物学的发展，糖的研究也取得了巨大进展，糖的其它诸多功能也不断被认识。有人预计，如同20世纪是蛋白质、核酸时代一样，21世纪应当是“多糖生命科学”的时代(31。1．1．1多糖的来源与分布第一章成的。一般多糖常由一百个以上甚至几千个单糖基组成，其性质已大大不同于单糖，如甜味和强的还原性已经消失。多糖按在生物体内的功能分为两类：一类水不溶的，主要是形成动植物的支持组织，如植物中的纤维素、甲壳类动物的甲壳素等，分子呈直糖链型。另一类为动植物的贮存养料，可溶于热水成胶体溶液，可经酶催化水解释放单糖以供应能量，如淀粉、肝糖原等，多数为支糖链型分子。高等植物、藻类、细菌类以及动物体内均有多糖存在。在动物体内主要存在于细胞膜中，而在植物和微生物体内主要存在于细胞壁中。根据组成与结构的不同，多糖的种类不计其数。到目前为止，人们已经从自然界中提取出来的就有几百种，如仙人掌多糖、金耳多糖、海带多糖、螺旋藻多糖、灵芝菌多糖、鲍鱼多糖、鲨鱼软骨多糖等。1．1．2多糖的化学组成及结构糖类又称碳水化合物，是仅．碳原子上带有多羟基醛或多羟基酮，或者通过水解能生成多羟基醛(或酮)的化合物。根据结构和性质可分为四类：单糖、二糖、寡聚糖(含三个以上的单糖)和多糖。糖分子中一般都含有几个不对称原子，所以大都具有旋光性。图1、2为单糖D一葡萄糖和D．葡萄糖醛酸的结构图，图3为一种。多糖纤维素的结构图，通过图可以直观地看出多糖纤维素是由许多直链葡萄糖连接而成的，进而可知多糖是由许多单糖分子，通过苷键连接而成。由于连接方式不同，可以形成直链多糖、叉链多糖，有时也可以形成环状的多糖。C一、”{，说明香菇多糖对由泡状口角炎病毒感染引起的小脑炎有明显的治疗和预防作用。1．1．3．5抗辐射据报道，某些多糖具有增强机体抗辐射功能的效果。中国茶叶研究所与天津卫生防疫站等单位合作，用茶叶多糖对小白鼠皮下注射后照射C，结果注射茶叶多糖的小白鼠成活率比对照组成活率高30％t17】。研究结果表明，螺旋藻水溶性多糖也具有显著的抗辐射功能。1．1．3．6其它在制备鹿茸精废渣中获得的多糖有降低胃酸含量抑制胃蛋白酶活性的作用。新疆雪莲中酸性多糖的钙盐，水解后有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖及糖醛酸，有早期引产作用19J。海带多糖有助于减肥的作用。油柑多糖具有清除氧自由基的作用。桑叶中特有的生物碱DNJ(1-deoxyn-ojirmycin)及其衍生物作为一种高效的OL．葡萄糖苷酶抑制剂，更是在控制血糖方面表现得特别突出。年Shart等首次报道了桑叶水提取液的降血糖作用。陈福君等报道了自桑叶中提取的桑叶总多糖(totalpolysacchafideofMorns，TPM)对四氧嘧啶糖尿病小鼠有显著的降血糖作用，TPM的结构有待于进一步研究。方晓等研究了桑叶浸出液对糖尿病大鼠降血糖作用，试验发现对实验性糖尿病大鼠有显著的降血糖作用，并初步认为降血糖的活性成分为生物碱。Asano等人从桑叶和桑枝中分离出18种生物碱，并确定了其结构。Kimura等观察了以上6种化合物对SIZ引起的糖尿病小鼠降糖作用，实验结果表明，N．MeDNJ、GAL．DNJ、第一章宫司进之等制备了大花紫薇与桑叶提取物的混合物，发现此混合物对四氧嘧啶糖尿病模型大鼠的血糖升高有抑制作用。佐藤修--[73】报道，用桑叶50％甲醇提取物(m)作大鼠小肠管流实验，在ME(相当于0．1％桑叶)共存时迅速抑制蔗糖吸收，中止加ME时，立即恢复。显示桑叶成分对二糖类分解酶(sucrase)活性的抑制作用。饭冢幸澄等将桑叶水提，冻干作试验材料(得率55％)，7周龄Wistar雄性大鼠，给药剂量，10，1mg／kg，注入门静脉，30～min后外周静脉血葡萄糖分别降至50％、20％、7％。显示桑叶的提取物作用于淀粉消化的最后阶段，对二糖酶(麦芽糖酶和乳糖酶)有明显的抑制作用，桑叶提取物可能是控制餐后血糖的有效手段。结合，并将其加入到饮料中，这种饮料比单独的DNJ或者是桑叶中所含的DNJ更能有效地抑制血糖的上升。Hosseinzadch等先用乙醚脱脂8h；张琳华等【用无水乙醇浸泡过夜，然后80℃回流处理2h，再加入去离子水使溶液中的乙醇浓度达到80％，在50℃水浴中回流4h，过滤风干。桑叶多糖的提取，常用的方法主要为热水浸提法(即水煎煮法)和超声提取法。热水浸提法【slJ：称取碾碎的干桑叶粉末，加入一定量的蒸馏水，于热水浴下提取，提取2～3次。抽滤除去杂质，合并滤液。将滤液旋转蒸发浓缩，调节pH值，加入一定体积的无水乙醇沉淀后将样品在冰箱中放置，抽滤取沉淀。将沉淀分别佣无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，真空干燥即得醇沉的桑叶多糖粗品。第一章超声提取：取碾碎的干桑叶粉末，加入一定比例的蒸馏水，于超声水浴中提取。浓缩、醇沉工艺与水提取法相同。超声提取法与水煎煮法相比有以下特点：1．提取过程中不用加热，可避免由于温度过高造成多糖的分解。2．提取时间短，有效成分溶出较快。一般水提法至少要1个半小时，而超声法只需半个小时。3．超声提取的影响因素很多，也十分复杂，限于时间和实验条件，对超声波功率、频率、溶剂和温度等因素未作考察，尚待进一步研究。4．超声法对设备要求较高，目前只限于实验室规模。1．2．3．2多糖的纯化方法由于桑叶粗多糖中很大部分是无机物小分子，因此在多糖的提取工艺中，去除小分子是一个重要的环节。常用透析法去除小分子。脱除蛋白质多采用Savage法或三氯乙酸法。Sevage法在避免多糖降解方面有较好的效果，但效率低，如能配合酶法提取，Savage法脱除蛋白质效果会更好，而且可以减少有机试剂的消耗量和多糖的损失。提取的桑叶多糖颜色较深，所以要对多糖进行脱色处理。最常用的方法是用活性炭处理脱色，但活性炭会吸附多糖，造成多糖损失：也有文献提到AB．8大空吸附树脂纯化多糖，主要的作用也是脱色。进一步纯化还有柱层析，即葡聚糖凝胶过滤分离。1．2．4桑叶保健品的开发利用1．2．4．1桑叶茶的研制由于桑叶中的营养成分在初冬霜期含量最高，因此，利用桑叶制茶，以霜后叶最佳。桑茶营养丰富，含有大量人体生长发育所必须的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素等，极易被人体吸收。同时，桑茶中富含多种微量元素，功效奇特，是纯正的天然营养品，被称作“长寿茶”。1．2．4．2桑叶汁饮料的开发研制近年来，“标签饮料”(不含防腐剂、人造色素、人造香精)越来越受到人们的青睐。天然和保健饮料既能补充能量、维持人体平衡，又能增进人体健康、增强免疫力，已逐渐成为软饮料工业的发展趋势。新鲜桑叶经过预处理(拣选、浸泡、清洗)、热烫护色、破碎、浸提、粗滤、煮沸、调配、精滤、罐装、排气杀菌等工艺流程，生产出的天然桑叶汁饮料作为改善传统的桑叶利用结构和开发新型保健品的尝试，它具有良好的亮绿色，酸甜适口，清爽宜人，无异味，略带桑叶本身涩味，是一种风味独特的新型天然饮料。要使绿色桑叶汁保持较强的稳定性，应在加工时从避光、排氧、杀菌消毒等方面严格控制工艺条件。第一章1．2．4．3功能食品——桑叶面条的研制功能性食品是对生物体具有明显调节和舒缓作用，维持和增进生物体健康功能的食品，桑叶面条即为功能食品的一种。以新鲜桑叶为原料，将其添加于挂面中，制作成具有保健效果的桑叶食品——桑叶挂面。桑叶挂面质地光滑细腻，筋力强，可嚼性好，具有天然桑叶的清香味，无异味。面条色泽淡绿，均匀自然。桑叶挂面具有特殊的营养功能与保健作用，可增补体内的微量元素和矿物质，改善机体的营养状况，增强抵抗力，是天然的绿色保健食品。1．2．4．4桑叶粉末的开发利用桑叶(粉末)有两种：一种是将桑叶原封不动地粉碎并通过目筛而制成的粉末，它可用于制饮料等保健品；另一种是将桑叶提取的浸出物进行处理制成的粉末。桑叶末呈绿色，有绿茶香，可加工成切面、饼干及商品化的混合茶、药片等。1．3多糖展望近10年来，多糖的研究在引起化学家兴趣的同时也在引起药理学家和生物学家的极大兴趣，药理药效方面的研究也非常广泛和深入。虽然多糖为一类重要的生物活性物质，但到目前为止，只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖、茯苓多糖等用于临床，而它们在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、愈溃疡、提高免疫力等方面的潜力已显示了诱人的前景，并随着多糖制备、结构、合成、药理学及临床学研究的不断深入，其药用市场将更加广阔。然而；从较低含量植被中有效提取分离的技术、质量控制的标准、结构测定及合成等问题仍是未来继续努力的方向。可以展望，多糖研究必将成为药物学和分子生物学领域中不可缺少的重要组成部分，并将为人类消除疾患中发挥巨大的作用。第二章第二章实验部分2．1实验材料2．1．1原料的来源及预处理本实验中使用的桑叶为河北产地，全部采购于天津市中药饮片厂。干燥的桑叶经粉粹后过筛，其粒度分布状况见表2．1。表2．1桑叶的粒度分布Table2-1oftheleavesGranuladiymulberry将粉碎的桑叶原料装入圆底烧瓶里，加入一定体积的无水乙醇，放置过夜，然后80"C回流处理2h，去除脂溶性成分。加入去离子水使溶液中的乙醇浓度达到80％，在50。C水浴中回流4h，以除去桑叶中单糖、双糖、低聚糖、苷类、生物碱、氨基酸等物质。回流完毕，离心分离取滤渣，滤渣风干后作为预处理过的桑叶。备用。(后文中提到的桑叶未经特殊说明都为预处理过的桑叶)2．1．2实验试剂本实验所用到的试剂列于表2-2。表2-2试剂来源及规格Table2-2Sourcesandofthespecificationreagents第二章2．1．3实验仪器本实验所用到的仪器列于表2．3。表2．3实验仪器列表Table2-3Listofinstrumentsexperimental2．2分析方法本实验采用硫酸．葸酮法进行桑叶多糖含量的测定，测定的主要为中性多糖。糖类遇浓硫酸水解、脱水生成糠醛或其衍生物，可与葸酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于nm处有最大吸收(见图2．1)，显色后在nm处的吸光度与多糖浓度成线性关系。第二章图2．1多糖显色后紫外扫描光谱图ScanoffromleavesspectrumFigure2一Ipolysaccharidemulberry2．2．1标准溶液的制备精密称取葡萄糖标准品．2mL容量瓶mg(．．c干燥至恒重)，置于中，加水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。

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