基于GC-MS的代谢组学方法来了解来自两种不同环境的大麻种子的营养价值

(FoodChemistry)

(Q1;IF:6.)

摘要Abstract

火麻具有重要的药用价值，是一种重要植物。本文通过GC-MS对两个不同环境下的火麻籽进行了非靶向代谢组学研究。共观察到种代谢物，其中43种代谢物在两类种子间差异显著(P≤0.05)。在营养学上比较重要的氨基酸、大麻素、生物碱和脂肪酸的定性和定量检测发现，高海拔温带喜马拉雅山脉的火麻籽(CAN2)比低海拔亚热带(CAN1)的火麻籽更具营养。CAN2的种子油中含有亚油酸和α-亚麻酸而CAN1中没有。甲醇提取物的还原力和DNA损伤试验表明，CAN2具有较高的抗氧化和营养潜能，这与该种子的酚类和黄酮类化合物的代谢含量相对CAN1较高相一致。本文进一步讨论了环境对种子抗氧化和营养价值的影响。

简介Introduction

火麻科的火麻自古以来就是一种重要的植物。它被认为起源于中亚，是纤维、营养和精神药物的来源。尽管该植物的分类尚不统一，但存在两个明显具有形态和化学成分差异的主要物种，即印度大麻和大麻。根据四氢火麻酚酸(THC-A)和火麻酚(CBN)相对于火麻二酸(CBD-A)的比例，可以分为药物型(值1)或纤维型(值低于1)。火麻素和火麻基产品已用于慢性疼痛、多发性硬化、难治性癫痫以及与化疗相关的恶心和呕吐。这些药物也用于治疗其他疾病，如抽动秽语综合征、焦虑症、创伤后应激障碍和精神分裂，但效果有限。在大多数法律监管制度下，0.2%的THC是种植类火麻用于生产纤维和种子的上限。

火麻籽作为人类食物以及纤维在纺织品中的应用可以追溯到史前。火麻籽含有约35%的油脂、20-25%的蛋白质、20-30%的碳水化合物、10-15%的不溶性纤维、5%的灰分、维生素和矿物质。火麻籽油含有丰富的多不饱和脂肪酸(超过80%)，如亚油酸(55-60%)、α-亚麻酸(15-20%)、γ-亚麻酸(~5%)和十八碳四烯酸(~1%)。火麻籽也是储存蛋白质——麻仁球蛋白(60-80%)的极好来源，含有较高的精氨酸和谷氨酸。除此之外火麻籽还具有较高的自由基清除和抗氧化活性，这归因其中咖啡酰酪胺、火麻素、生育酚和天然酚类的含量较高。

代谢组学是在一定时间内检测大量代谢物的重要分析方法，已被广泛应用于食品和营养研究。各种代谢组学平台，如液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、核磁共振(NMR)等与各种生物信息学工具相结合，极大地促进了代谢组学方法的发展。其中，GC-MS是一种简单、快速、可靠和有影响力的分析方法，在分析挥发性和热稳定化合物和主要代谢物，包括糖、氨基酸、有机酸和多胺以及生物合成途径前体方面表现突出。近年来，已经针对不同的植物进行基于GC-MS的种子代谢组研究，并得出它们在生理和代谢过程中代谢物水平的差异。

虽然人们已经对火麻种子的一般特性、抗氧化活性和精神药物作用进行了大量的研究，但到目前为止，还没有人用代谢组学的方法对火麻籽进行系统的评价。此外，还没有鉴定大麻种质中具有营养意义的种子代谢物的相关研究。因此，本研究拟利用非靶向代谢物图谱研究两种不同气候条件下生长的火麻籽的代谢物的组成，以了解它们的营养性。此外，还进行了抗氧化和自由基清除的研究，以验证其营养意义。

结果和讨论

Resultsanddiscussion

代谢物图谱显示不同种质间存在差异

将CAN1和CAN2经过衍生化和GC-MS分析，并将鉴定的质谱与NIST17文库进行比较，共鉴定出种结构已知的代谢物(CAN1和CAN2分别为和)。代谢产物包括不同浓度的脂肪酸、糖、羧酸、氨基酸、有机酸、多胺、碳水化合物和多酚。

为了得到一个稳定的代谢组学数据，仅对在至少在三个重复中均检测到的那些代谢物以进行分析，则两份材料共检测到个代谢物，这包括CAN1和CAN2中的98种和种代谢物。为了了解CAN1与CAN2的不同之处，重复项之间的相似性以及哪些代谢物（变量）对这种差异的影响最大，对两个材料中共同存在的种代谢物进行了主成分分析(PCA)。结果显示有69%的变异，两个材料的聚类不重叠，表明两个材料的代谢物水平发生了变化。PCA1检测到50.6%的变异，PCA2检测到18.4%的变异(图1A)。根据负荷图，因子1和因子2中的分离不是由于特定的代谢物，而是多种代谢物的综合作用(图1B)。

图1A与B

单因素分析发现CAN2中有24种显著代谢物(p≤0.05)，包括氨基酸、脂肪酸、大麻素和维生素，而CAN1中有19种显著代谢物(p≤0.05)，包括羧酸、酚酸、碳水化合物和有机酸(图2)。通过对两个材料中存在的前50个代谢物生成的热图进行系统聚类，两个材料中的代谢积累变得明显(图3)。确定了两个主要的簇，它们具有不同的代谢物丰度变化模式。代谢物聚集的模式清楚地表明了代谢变化，在花生和水稻中很明显。在CAN1或CAN2中显著较高(p≤0.05)的单个代谢物在补充文件S2中列出。

图2

图3

天冬酰胺、苯丙氨酸、高丝氨酸、L-丝氨酸和L-酪氨酸等氨基酸含量显著高于对照组(p≤0.05)。天冬酰胺是植物氮代谢中的一种关键化合物，是氮储存和运输到下沉组织的主要形式。它还在植物对病原体侵染的防御反应中发挥作用。苯丙氨酸是一种前体分子，大部分酚类分子来源于莽草酸代谢途径。L-丝氨酸参与多种细胞过程、信号机制，并参与细胞增殖所需的各种分子、氨基酸、含氮碱基、磷脂和鞘磷脂的生物合成。芳香氨基酸是植物体内许多次级产物的前体，包括黄酮、酚酸、香豆素和生物碱。高丝氨酸是天冬氨酸途径的中间氨基酸，可形成必需氨基酸，包括蛋氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸。在CAN2中发现的其他重要显著代谢物(p≤0.05)包括大麻素、脂肪酸(壬烷酸、油酸和蓖麻油酸)、烟酸和胡芦巴碱。据报道，大麻类化合物具有抗氧化作用，以及神经保护、炎症、肥胖和代谢综合征益处。油酸是一种不饱和脂肪酸，被认为在人类健康中发挥着许多生理功能，如调节胆固醇水平、炎症活动，并可能有助于预防动脉粥样硬化。蓖麻酸以其通便特性以及抗炎和镇痛活性而闻名。烟酸(维生素B3)在氧化还原过程中起着重要作用，在氧化还原过程中，烟酸被转化为烟酰胺，其次是NAD和NADP。胡芦巴碱是一种植物生物碱产品，已被证明对糖尿病和中枢神经系统疾病有益。

为了鉴定两个材料之间的重要代谢物，利用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和SAM对两份材料之间的重要代谢物进行了分析。PLS-DA根据五组分模型的VIP值确定了最重要的代谢物(图1C)。VIP大于1的变量被认为是重要的。共鉴定出53个化合物(VIP1)。类似地，SAM还基于代谢物的d值为0.1、假发现率为0.71和假阳性为73.75来检测相同的代谢物(补充文件S3)。

图1C

代谢途径

使用拟南芥作为途径文库的来源，在两个材料中总共鉴定了56个途径(补充文件S4)。在这些途径中，当比较来自两种不同环境的材料时，发现20个途径在本研究中受到影响(图1D)。

图1D

这些途径中的六种代谢(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、酪氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、苯丙氨酸代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢)与氨基酸合成和代谢有关。其他六种受影响的途径(丙酮酸代谢、肌醇磷酸代谢、半乳糖代谢、TCA循环、乙醛酸和二羧酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢)与碳水化合物代谢有关。次生代谢产物的生物合成，包括异喹啉生物碱生物合成，丁酸盐代谢，角质，次生素和蜡生物合成，谷胱甘肽代谢也被影响。此外，与脂肪酸代谢相关的两条途径(亚麻酸和α亚麻酸代谢)和初级生物合成途径也受到影响。这一结果表明，在这项研究中受到影响的代谢物及其途径具有营养相关性。同样，在奇亚籽代谢组学研究中，脂肪酸和有机化合物在不同灌溉方式下受到的影响最大。

提取物的抗氧化性分析

补充文件S5中展示了使用索氏提取两类种子的籽油得率。发现CAN1（36％）的油产率高于CAN2（31.2％）。以CAN1的氯仿提取法（CH）获得最大的得率（43.63％），而以CAN1的氯仿/甲醇（CH/ME）获得最小的产率（2.5％）。同样，在辣木种子中的氯仿中观察到更高的提取率。当我们同时使用极性（甲醇）和非极性（氯仿）时，在非极性溶剂中的收率很高，因为已证明它可以与非脂肪物质一起提取油。然而，酚类和黄酮类化合物的提取在极性溶剂中得到了最好的报道。因此，对甲醇提取物进行了抗氧化剂活性的比较。

总酚含量在0.mg~1.15mg/mg

没食子酸当量之间变化，在CAN2的ME组分中含量最高(表1).黄酮类化合物的含量范围为0.19mg~1.56mg/mg槲皮素当量，以CAN2的ME组分含量最高。早前有报道称甲醇可以从种子中提取极性酚类物质。我们的结果与之前对火麻籽中酚类含量的研究相一致或发现更高。各组分的DPPH%抑制率在26.47%到81.09%之间，甲醇(CH/ME和ME)组分的抑制率较高(表1)。两种材料CH组分的抑制率都很低，这与酚类和黄酮类化合物的含量相吻合。然而，在两种材料中没有观察到自由基清除活性的差异。在我们的研究中发现，DPPH活性好于早期评估的大麻种子，后者仅显示出40%的抑制率。然而，在另一项研究中，发现最高的抑制率是在水溶液中。与CAN1相比，CAN2中还原铁离子的铁还原/抗氧化能力显著提高(p≤0.05)，而螯合能力则没有观察到影响(表1)。

表1

植物组织中大部分营养保健性都归因于高含量的酚和类黄酮的存在。酚类化合物通常在植物中发现，这与它们的氧化还原特性有关，它们可以充当还原剂，氢供体和单线态氧猝灭剂。这与我们的FRAP活性相吻合，但似乎与DPPH或螯合活性无关。有人认为，这些芳香族抗氧化剂的抗氧化效果与芳香环中-OH数量成正比，而–OH基团的排列有助于螯合氧化性金属，活化抗氧化酶并形成抗氧化性能的加合物。代谢组学分析中观察到的CAN1和CAN2黄酮类化合物的定性和定量差异可能是这两个材料活性差异的一个推测原因。其他研究也表明了酚类和黄酮类化合物在大麻种子抗氧化潜力中的作用。我们的结果与超声波处理后火麻种子的活性相似。

提取物对DNA的保护能力表明，所有提取物都能防止DNA的断裂。然而，根据该假设，在ME的CAN2部分发现最高活性，其次是CH的CAN2(图4)。如前所述，这种活性与在各种成分中检测到的总黄酮直接相关。所有的有机分子，包括DNA，都容易受到各种氧气或硝氧基反应物种的氧化损伤。尽管有大量主要从食物中获得的抗氧化化合物，但每天都会发生实质性的损害。据我们所知，这是第一份关于火麻籽的DNA保护活性的研究

图4

火麻油和大麻素特征分析

提取的种子油的气相色谱-质谱分析表明，与CAN2相比，CAN1存在定性和定量差异(补充文件S6)。包括萜烯、脂肪酸、大麻素和反式石竹烯在内的重要营养物质化合物仅在CAN2中发现或CAN2含量更高。火麻籽中具有抗氧化特性的萜烯包括β-石竹烯、柠檬烯和β-月桂烯。油脂的脂肪酸组成表明，CAN2也是多不饱和脂肪酸的来源，表现为含有亚油酸、α-亚麻酸和油酸。多不饱和脂肪酸，如亚油酸(18：2)和亚麻酸(18：3)被称为必需脂肪酸(EFA)，因为它们在人体内是必需的。亚麻酸是一种已知的将生物活性化合物输送到皮肤中的促进剂，它被转化为花生四烯酸，花生四烯酸是强大的荷尔蒙类化合物的前体。

根据现有标准(表2，补充文件S7)的保留时间，使用基于HPLC的方法鉴定了7种不同的大麻素。此外，利用m/z比验证了所鉴定的峰。与CAN1ME组分相比，CAN2ME组分中大麻素的浓度显着升高(p≤0.05)。CAN1和CAN2被发现含有0.%和0.%的THC，远低于禁毒办建议的种植火麻的法定上限。包括THC/CBD和CBG在内的几种大麻类化合物显示出抗氧化特性。因此，低于法定限度的THC含量的种子的提取物具有重要的营养性。早些时候，对几种CBD油的深入分析表明，其浓度与申报的数量有显著差异，证明有必要实施严格和标准化的监管。

补充文件S6

表2

补充文件S7

CAN2的营养优势可能是环境作用

在来自不同地理气候地区的两份材料CAN1和CAN2中，代谢组和抗氧化剂数据表明，具有营养重要性的化合物要么含量更高，要么只在CAN2中存在。CAN2是从海拔m的喜马拉雅西部温带地区采集的，该地区的温度和光强随生长期变化很大。早些时候有人提出，较低的温度和较高的光照强共同作用导致较高的抗氧化剂含量生成。在酚类化合物含量和抗氧化剂/叶绿素比值方面表现出明显的海拔影响，证明了与低海拔地区的植物相比，高海拔植物对较高的太阳辐射的反应更强，从而证实了这些地区植物种类的抗氧化能力更强。这也解释了为什么CAN2具有更高的酚类和类黄酮，以及更高的抗氧化潜力(p≤0.05)。

结论

Conclusion

这是首次基于GC-MS的火麻籽代谢组学评估研究。来自不同环境的两类火麻籽显示了属于不同类别的总共个非目标代谢物。对代谢物的详细分析表明，就营养性而言，高海拔种子比低海拔种子具有优势。CAN2中几种氨基酸、大麻素、脂肪酸和维生素的含量较高(p≤0.05)，具有特异性或显著性。酚类和黄酮类化合物的代谢含量在高海拔（喜玛拉雅）地区的种子中也较高，这有利于其抗氧化。研究结果表明，环境可能在生成这些特定代谢物的特异性和浓度方面发挥了重要作用。

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